תרכובות פנוליות שמקורן בשפכי בתי בד מגבירות את קצב הגדילה וההתפתחות של צמחייה הסובלת מעקת מלח

מבוא

אחת התוצאות החמורות של תופעת שינוי האקלים היא הפגיעה בחקלאות בעקבות העלייה בריכוז המלח בקרקעות. קצב ההתאיידות הגבוה הנגרם מהעלייה בטמפרטורה מגדיל את ריכוז המלח בקרקע. ההתמודדות עם האיום הזה מחייבת פתרונות מתקדמים לשמירה על יציבות המערכת האקולוגית והביטחון התזונתי העולמי.

קרקע חקלאית נחשבת מלוחה כאשר ריכוזי המלחים בה הוא מעל ל-3,000 חל"מ (חלקיקים למיליון, ppm) או כשהמוליכות החשמלית שלה היא מעל 500 מיליסימנס, ונחשבת בעלת מליחות בינונית בטווח ריכוזי מלחים של 1,000–3,000 חל"מ או כשהמוליכות החשמלית שלה היא 167–500 מיליסימנס. בריכוז מלחים נמוך יותר הקרקע הנחשבת רגילה ובלתי מלוחה ^[13]. המלחת קרקעות חקלאיות היא בעיה עולמית המשפיעה על כ-20% מהקרקעות המושקות, מה שעלול לגרום להפחתה מהותית בכמות היבולים המופקים בשטחים אלה ולהעמיד בסכנה את הביטחון התזונתי עבור אוכלוסיית העולם הגדלה ^{[2, 10]}. את רוב מיני הגידולים החקלאיים לא ניתן לגדל בקרקע מלוחה. צמחים מתמודדים עם עקת מלח, בין השאר, בשינויים ברמת ביטוי הגנים, שבסופו של דבר יכולים להביא לשחרור רעלים, כגון מי חמצן, הנוצרים בשל חשיפת התאים למלחים. כאשר מי החמצן נוצרים, הם יכולים להפעיל תגובות הגנה נוספות כדי להביא לשיקום המאזן בתוך התאים ולהתאוששות הצמיחה ^[16]. כמו כן, עקות סביבתיות בכלל, ועקת מלח בפרט, מפעילות לעיתים קרובות מסלולי איתות דומים, המתבטאים גם הם ברמת ביטוי הגנים. מסלולי האיתות גורמים להפרשת חומרים, כגון חלבוני עקה, ולהעלאת רמת נוגדי חמצון שמנטרלים את ההשפעה השלילית של פעולת החמצון שנגרמת ממלח וממי חמצן שנוצרים כתגובה לו. בעקבות ביטוי מוגבר של הגנים המשופעלים בשל החשיפה לריכוזי המלח מצטברים מומסים ספציפיים, כגון כליומן (chelomin), פפטידים נוגדי חמצון ותרכובות פנוליות ונגזרותיהן, שמטרתם הגנה על התאים מפני נזקי החמצון.  חומצה אצטילסליצית (acetylsalicylic acid)היא דוגמה לתרכובת פנוליות, וחומצה אסקורבית (המוכרת כוויטמין C) וחומצה ג'סמונית (jasmonic acid) הן דוגמאות לנגזרות של תרכובות פנוליות. כל המומסים האלה מפחיתים את הנזק שנגרם מעקת המלח. בהקשר זה, דווח כי חשיפת צמחים שסובלים מעקת מלח לתרכובות הפנוליות ולנגזרותיהן יכולה לנטרל את ההשפעה השלילית של עקת מלח על צמחים. התרכובות האלה פועלות כמצע ראשוני במסלול אנזימטי ביוכימי בתוך התאים, שיכול להביא לנטרול רעילותם של מי חמצן המצטברים בתאים בעקבות חשיפת הצמח לעקת מלח. נוסף על כך, החומצות הללו מתפקדות כנוגדי חמצון וממלאות תפקיד מפתח בוויסות ובצמיחה של צמחים הסובלים מעקה ^[3].

שפכי בתי הבד נוצרים בתהליך ייצור שמן הזית בעיקר במערכת התלת-פאזית המאופיינת בניצול כמויות גדולות של מים בעת הסחיטה, ולבסוף במיצוי השמן בשיטת הצנטריפוגה. בזמן הסחיטה נוצרות שלוש פאזות: שמן, שפכים ופסולת מוצקה. בתהליך זה מוסיפים מים כדי לשפר את ההפרדה בין שני התוצרים: שמן וחומר מוצק. המערכת התלת-פאזית מאופיינת בכך שמכל טונה של זיתים מתקבלים כ-0.2 טונה של שמן זית (המקבילים ל-0.217 מ"ק) ועד 1.6 מ"ק של שפכי בתי בד ^{[6, 17]}. כלומר, נפח השפכים הוא בערך פי 7–8 מנפח השמן שמופק. מדי שנה, במהלך התקופה הקצרה של מסיק עצי הזית והפקת שמן הזית, משתמשים ברחבי העולם בכ-12 מיליון טונות של זיתים לייצור כ-2.4 מיליון טונות שמן זית (המקבילים ל- 2.6 מיליון מ"ק), ובתהליך נוצרים כ-19.2 מיליון מ"ק של שפכי בתי בד שהם 7–8 פעמים יותר מנפח השמן הנוצר ^{[8, 14]}.

טירוזול (tyrosol) והידרוקסיטירוזול (hydroxytyrosol) (איור 1) הם תרכובות של פנולים פלבנואידים הנמצאות בשמן זית, ותורמות לטעמו המר ולעפיצות. נוסף על כך, הן נחשבות למרכיב בריאותי רצוי בשמן הזית ^[15], בשל היותן נוגדי חמצון טבעיים בו, והן ניחנות בשורה של השפעות מועילות, החל מריפוי כוויות שמש ועד הורדת כולסטרול, לחץ דם וסיכון למחלות באופן כללי ^[11]. שפכי בתי הבד עשירים בפנולים (תרכובות אורגניות המבוססות על פנול) שניתנים להפקה ולניצול כנוגדי חמצון טבעיים לתעשיות המזון והתרופות ^{[7, 18]}. בדרך כלל, 2% מסך הפנולים נמצאים בשמן זית, ו-98% עוברים לשפכים ^[11].

איור 1

המבנה הכימי של טירוזול והידרוקסיטירוזול

התרכובות האלה מתאפיינות בטבעות פנוליות, ושכיחות בשמן זית ובקליפת פרי הזית. חומרים פנוליים נוספים יכולים לחקות את הפעילות של טירוזול והידרוקסיטירוזול הודות למבנה הכימי הדומה שלהם.

במשך תקופה ארוכה נחשבו שפכי בתי בד כפסולת מסוכנת ובעלת השפעה שלילית על הסביבה, ויצרו עומס כלכלי על תעשיית שמן הזית. עם זאת, בעשור האחרון השתנתה ההשקפה הזו, והשפכים זכו להכרה כחומר מוצא פוטנציאלי המאופיין בעלותו הנמוכה ובעושר תרכובות אורגניות המאופיינות בפעילות ביולוגית וכימית, בייחוד פנולים, כפי שצוין לעיל. שפכי בתי בד הם מקור עשיר של חומרים נגד פטריות, ויש להם ערך כחלופה לקוטלי פטריות כימיים בלתי פריקים ביולוגית. פעילותן החזקה של תמציות עשירות בהידרוקסיטירוזול כקוטלות פטריות נבחנה בהצלחה נגד Botrytis cinerea בעגבניות ^{[9, 21]}.

צמח הריחן (בזיליקום, Ocimum basilicum) הוא צמח עשבוני ממשפחת הקנבוניים. הריחן נמצא בשימוש נרחב במטבחים וברפואה העממית, והוא ידוע בריחו ובטעמו הייחודיים ^[19]. לשימוש בריחן כצמח מודל במחקר יש יתרונות רבים, היות שקל לגדל אותו ולעקוב אחרי התארכות הנוף (החלק הירוק בצמח) והשתנות מספר העלים, ומפני שהוא מכיל תרכובות אורגניות (כמו פנולים ונגזרותיהם, פלבונואידים, פלבונולים ואלכוהולים) שעשויות להיות מעורבות במנגנון ההתמודדות עם עקת מלח ^[4]. כמו כן, הריחן מכיל תרכובות נוגדות חמצון, שיכולות לסייע בהגנה על תאים, ולכן סביר להניח כי שהן יכולות לנטרל את השפעת החמצון שנגרם בגלל חשיפת השורשים לעקת מלח ^[12]. במחקר שנערך לאחרונה הראו החוקרים כי פנולים ותמציות טבעיות בודדות שמקורם בשפכי בתי הבד, הם מרכיבים פעילים התורמים להגברת הסבילות (tolerance) של צמחים לעקת מלח ^[12]. במחקר הנוכחי בוצע מעקב אחרי השפעתו של הידרוקסיטירוזול על קצב התארכות צמחי ריחן ועל מספר העלים על הצמח. שאלת המחקר היא מהי השפעת ריכוזים שונים של הידרוקסיטירוזול על התאוששות צמחים הנתונים בעקת מלח?

שיטות וחומרים

המחקר בוצע במכון לחינוך מדעי-טכנולוגי, אקדמיית אלקאסמי, על-ידי צוות תלמידים מכיתה י"ב מהמגמה המדעית בבית הספר מקיף אום אלפחם. התלמידים ביצעו את המחקר במעבדה ובהנחיה של צוות המכון. התלמידים עם צוות המדעים בבית הספר יזמו את המחקר לאחר ביקורים במכון לחינוך המדעי באקדמיית אלקאסמי, ולאחר שהתרשמו מהנעשה במכון, החליטו להצטרף לצוות המחקר במעבדות המכון.

גידול הצמחים

שתילי ריחן נרכשו ממשתלה בגליל וגודלו בעציצים בנפח של 500 מ"ל בתוך קרקע מסוג טרה רוסה במשקל 0.5 ק"ג, בהתאם לתיאור השיטה ^[1]. השתילים היו אחידים מבחינת הגיל (כ-20 ימים), הגובה (15–18 ס"מ) והמצב הפנולוגי (עלווה, כ-15 עלים בממוצע). הצמחים הועברו לחדר נביטה עם תנאים מבוקרים: טמפרטורה של 27±2 מעלות צלזיוס, תאורה של 35 ואט למ"ר במנורות לֵד לפרק זמן של 12 שעות ביממה, ולחות של 35% ביום ו-60% בלילה. מערכת הניסוי הורכבה משלוש קבוצות עיקריות: 1) צמחי הביקורת גודלו שבעה שבועות (49 ימים) עם השקיה בתמיסה רגילה ללא מלח וללא הידרוקסיטירוזול; 2) צמחי הטיפול א' גודלו שישה שבועות (42 ימים) עם השקיה יומית ב-35 מ"ל תמיסת מלח (NaCl בריכוז של 80 מילימולר), שיוצרת עקת מלח בינונית והשפעה שלילית ברורה. בשבוע השביעי הושקו בתמיסה רגילה, וכך התאפשרה בדיקת התאוששות הצמחים מהעקה ^[4]; 3) צמחי הטיפול ב' גודלו שישה שבועות (42 ימים) עם השקיה בתמיסת מלח, אך מתחילת השבוע השביעי הושקו בתמיסה רגילה בתוספת ריכוזים שונים של הידרוקסיטירוזול (1, 2, 3 ו-4 חל"מ). תמיסת ההידרוקסיטירוזול נרכשה מחברת Sigma Aldrich.

קצב גדילת הנופים

כדי למדוד את התארכות הנופים עקבנו אחר ההתארכות היומית (ביחידות ס"מ) של אחד הענפים בצמרת הצמח. כל ענף כזה סומן בתחילת הניסוי בסרט אדום בכל מערכת ניסוי. קצב ההתארכות היומי (ביחידות ס"מ ליום) חושב על פי ההבדל באורך המצטבר בסוף הניסוי והאורך ההתחלתי, והתוצאה חולקה ב-49 ימים.

התארכות הנופים של קבוצת הטיפול ב' נמדדה בנוכחות הידרוקסיטירוזול בריכוזים שונים בהשוואה לקבוצת הטיפול א' שלא קיבלה הידרוקסיטירוזול, וגם בהשוואה לקבוצת הביקורת שלא סבלה מעקת מלח ^{[4, 5]}. התארכות הענפים המסומנים נקבעה ביחס לנקודת הקביעה הראשונית שהיא תחילת הענף ^[5].

שיעור העלים

בסוף הניסוי נספרו העלים בכל צמח בקבוצות הטיפול ובקבוצת הביקורת ומספרם הושווה למספר העלים המצטבר בצמחי הביקורת. שיעור העלים בכל טיפול חושב בהתאם למספר העלים המצטבר בסוף השבוע השביעי בהשוואה למספרם על צמח הביקורת (40 עלים). שיעור העלים על צמחי הביקורת הוגדר כ-100%.

עיבוד סטטיסטי

ההבדלים בין שש קבוצות הניסוי (ביקורת, תוספת מלח בלבד, תוספת מלח והידרוקסיטירוזול 1 חל"מ, 2 חל"מ, 3 חל"מ ו-4 חל"מ) נבדקו במבחן ANOVA חד-כיווני. הגרפים והמבחנים הוכנו באמצעות תוכנת המחשב 8 GraphPad Prism. בכל טיפול נעשה שימוש בחמישה שתילים (ריבוי פריטים), והבדיקות בוצעו בשלוש חזרות.

תוצאות

השפעת עקת מלח על גדילת הצמחים

קצב הגדילה היומי של צמחי הביקורת הוגדר כ-100% ונקבע כ-0.59 ס"מ ליום. נמצא שקצב הגדילה של צמחי ריחן שהושקו בתמיסת המלח ירד לשליש מערכו (34%) בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 2א). כשצמח סובל מעקת מלח, נפגע כושר קליטת המים שלו. בעקבות זאת פוחתים קצב התארכות הצמח ומספר העלים הצומחים בו, ובתנאי עקה חריפים הצמח יגיע לכמישה ולמוות. קצב התארכות הצמחים הלך וירד בשל ההשקיה המתמשכת בתמיסת המלח.

איור 2

השפעת עקת מלח על גדילת הצמחים

באיור מוצגים ממוצעי הקצב היומי לגדילת צמחי ריחן בעקת מלח ובריכוזים שונים של הידרוקסיטירוזול. (א) השפעת עקת המלח (80 מילימולר NaCl) על קצב ההתארכות היומי של צמחי ריחן במשך שבעה שבועות בהשוואה לקבוצת הביקורת; (ב) קצב ההתארכות היומי של הצמחים שגודלו במשך שבעה שבועות בעקת מלח (80 מילימולר NaCl), ורק בשבוע השביעי נחשפו לריכוזים שונים (0–4 חל"מ) של הידרוקסיטירוזול. מוצגים ממוצעים ושגיאת תקן עבור 3 חזרות שונות (ממוצע ± טעות תקן, n=3). האחוזים על העמודות מייצגים את קצב ההתארכות של הצמחים ביחס לקבוצת הביקורת שהוגדרה כ-100%. בוצעה השוואה בין הממוצעים על פי Tukey's multiple comparisons test בשני הגרפים. אותיות שונות פירושן הבדל סטטיסטי ברמת מובהקות 95%.

השפעת עקת מלח על מספר העלים

בצמחי הביקורת שהושקו בתמיסה נטולת מלח מספר העלים עלה עם הזמן. צמחים המציגים מחזוריות בהתחדשות העלים נותנים אינדיקציה חשובה לגידול תקין ונכון שלהם. כאשר מספר העלים עולה בצורה עקבית, הדבר מעיד על תהליך צמיחה סדיר ובריא. בניגוד לכך, כאשר מספר העלים בצמחים אינו גדל בצורה כזו, הדבר יכול להעיד על תנאי עקה. ההבנה המדויקת של מחזוריות התחדשות העלים כאינדיקטור לגידול בריא ותקין יכולה לשמש כלי בעל ערך להבנת השפעת תנאי הסביבה על גידול הצמחים. צמחי הביקורת, שלא נחשפו לתמיסת מלח לכל אורך הניסוי, ייצגו את מספר העלים המיטבי (100%). בהשוואה אליהם, מספר העלים בצמחי הטיפול שהושקו בתמיסת מלח ירד ל-38% ביחס לצמחי הביקורת, ונראה שתהליך הייצור של עלים חדשים נפסק בשל הטיפול במלח (איור 3).

איור 3

שיעור העלים בצמחי ריחן בעקת מלח ובריכוזים שונים של הידרוקסיטירוזול

(א) ממוצעי מספר העלים של צמח ריחן הגדל בעקת מלח (80 מילימולר NaCl) לאחר גידול של שבעה שבועות בהשוואה לצמחי הביקורת שלא הושקו במלח; (ב) ממוצעי מספר העלים של צמחי ריחן שגודלו במשך שבעה שבועות בעקת מלח (80 מילימולר NaCl), ורק בשבוע השביעי נחשפו לריכוזים שונים של הידרוקסיטירוזול. מוצגים ממוצעים ושגיאת תקן עבור שלוש חזרות שונות (ממוצע ± טעות תקן, n=3). האחוזים על העמודות מייצגים את שיעור העלים בתום שבעה שבועות ביחס לקבוצת הביקורת שגודלה ללא עקת מלח. בוצע מבחן השוואה מסוג Holm-Sidak's multiple comparisons test בין הממוצעים בשני הגרפים. אותיות שונות מעידות על הבדל סטטיסטי מובהק ברמת מובהקות של 95%.

השפעת תוספת הידרוקסיטירוזול על התאוששות צמחים שסבלו מעקת מלח

תוספת הידרוקסיטירוזול בריכוזים שונים לתמיסת המלח השפיעה בצורה מתמשכת על קצב התארכות צמחי הריחן ועל מספר העלים הכולל שלהם. ריכוז של 3 חל"מ נמצא כריכוז המיטבי שיכול לגרום להתאוששות מֵרבית של הצמחים מעקת מלח מבחינת קצב התארכות הנופים וכן מבחינת מספר העלים המצטבר על כל צמח, עד להגעה ל-93% ביחס לקצב הגדילה של הביקורת (איור 2), ועד כ-73% מבחינת מספר העלים הכולל על כל צמח (איור 3). בריכוזים גבוהים יותר של הידרוקסיטירוזול התקבלה דעיכה בקצב הגידול היומי, באורך הנופים המצטבר ובמספר העלים המצטבר.

דיון

במחקר זה נבחנה השפעתה של עקת מלח על צמחי ריחן בהשוואה לצמחי ביקורת שהושקו בתמיסת השקיה רגילה ללא מלח. נמצא כי תפקודם של הצמחים שסבלו מעקת מלח לא היה תקין מבחינת התארכות נוף הצמחים ומבחינת מספר העלים. כדי לבדוק את סיכויי ההתאוששות של הצמחים נבדקה השפעת תוספת הידרוקסיטירוזול לתמיסת ההשקיה מבחינת יכולת ההתארכות מחדש ויכולת העלאת מספר העלים. מסתבר כי תוספת של הידרוקסיטירוזול בריכוז 3 חל"מ לצמחים בעקת מלח גרמה להעלאת קצב ההתארכות היומי והגדילה את מספר העלים.

תוצאות המחקר הביאו מידע מועיל על השפעת הידרוקסיטירוזול על התאוששות הצמחים בעקת מלח. שפכי בתי בד עשירים בתרכובות פנוליות מגוונות בכלל ^[7], ובהידרוקסיטירוזול בפרט. מכאן, שהשקיית צמחים הסובלים מעקת מלח בחלקים מסוימים משפכי בתי בד, ובייחוד בחלקים שמכילים תרכובות פנוליות ונגזרותיהן, שעשירות בהידרוקסיטירוזול, יכולה לגרום להתאוששות צמחים הסובלים מעקת מלח. דווח כי הידרוקסיטירוזול יכול לגרום להרחבת נקבוביות בדפנות התאים בשורשים, ובכך הוא מעלה את זמינות המים לצמח ^[4]. בעקבות החשיפה למלח הצטמק קוטר הנקבוביות בדפנות תאי השורשים בצורה ברורה, אך החשיפה להידרוקסיטירוזול גרמה להרחבתן מחדש, וכך כושר קליטת המים דרך השורשים עלה בצורה מובהקת ^[4]. הידרוקסיטירוזול יכול לפעול כחומר נוגד חמצון וכך להשפיע על תהליכים ביוכימיים בתאים ^[11]. כדוגמה נוספת לתרכובות פנוליות שעשויות להימצא בשפכי בתי בד ^[11], נחקרה השפעת תוספת של חומצה אסקורבית לתמיסת ההשקיה של צמחים הסובלים מעקת מלח. חומצה אסקורבית יכולה להראות תוצאות דומות ולשפר את קצב ההתארכות היומי של צמחים בעקת מלח. החוקרים קישרו בין יכולתה של חומצה אסקורבית להעלות את כושר ההגנה בפני חומרים מחמצנים לבין פעילותה בהגברת יכולת ההתאוששות של צמחים השרויים בעקת מלח ^[2].

התועלת היישומית מתוצאות המחקר יכולה לתרום למציאת פתרון לשפכי בתי הבד העשירים בהידרוקסיטירוזול. בעונת המסיק שפכי בתי הבד מסולקים בקצב גבוה אל בריכות השיקוע, שבדרך כלל גודלן קטן. לכן, לעיתים העומס האורגני בבריכות עולה לרמות גבוהות, דבר שגורם לגלישת השפכים לנחלים סמוכים ^[17]. כיום אין מתקנים ייחודיים המתאימים לטיפול בשפכי בתי הבד, מכיוון שכמותם השנתית קטנה ביחס לשפכים ביתיים. הזרמה בלתי מבוקרת של שפכי בתי בד אל הקרקע גורמת לירידה בכושר החזקת המים של הקרקע (קיבול השדה) ובכושר החדירה של מים בקרקע (הולכת המים בקרקע) ^[20]. לכן, סילוק בלתי מבוקר של שפכי בתי בד לא מטופלים אל הקרקע עלול לגרום לזיהומה. נוסף על כך, שפכים לא מטופלים אלה עלולים לגרום לזיהום מי תהום, דבר המאיים על איכות משאבי המים במדינות הים התיכון הצחיחות, ומהווה מקור לדאגה.

מסקנות

פיזור שפכי בתי בד בצורה מבוקרת בשדות המאופיינים בקרקעות מלוחות עשוי לנטרל את ההשפעה השלילית של המלח המצטבר בקרקע. התאמה מרבית של תוכניות איסוף שפכי בתי בד למקומות היווצרותם ופיזורם בשדות עשויה לצמצם את בעיית השפכים מצד אחד, וגם לסייע בפתרון בעיית המלחת הקרקע. אימוץ פתרון שכזה ויישומו נתון בידי מקבלי ההחלטות במשרדי הממשלה האחראיים, כגון המשרד להגנת הסביבה ומשרד החקלאות ופיתוח הכפר.

מבחינה ביצועית יש לדאוג להפרדת החלק העשיר בפנולים ובנגזרותיהם מהשפכים ולפזר אותו בלבד בקרקעות מלוחות במטרה לטייב אותן (כפי שנדרש בחלק מקרקעות עמק יזרעאל) או להכשיר אותן לחקלאות (כפי שנדרש בחלק מקרקעות הנגב ומישור החוף). פעולה שכזו תרחיב את תחום הסבילות למליחות קרקע של מגוון רב של גידולים חקלאיים (כגון חיטה, סלק, גזר, תרד ותפוח אדמה), וגידולם ייעשה אפשרי גם בקרקעות שלא ניתן לגדל אותם בהן כיום. על מהנדסי מים וביוב המכינים תוכנית סילוק לסביבה של שפכי בתי בד לדאוג, בין השאר, למערך איסוף של שאריות השפכים, לאחר שהוצא מהם החלק העשיר בפנול ובנגזרותיו, ולדאוג למיהולו ולהעברתו למכוני הטיפול בשפכים.